提取酵母DNA

师兄这几天把上次的DNA用完了,这次我又重新提取了酵母的DNA。

还是用的试剂盒,在毕业报告里记录一下:

配制Sorbitol buffer

这一步比较简单,计算一下 10mL 去离子水需要多少山梨醇,需要多少Na2EDTA即可。

计算结果:1.82g 山梨醇,0.374g Na2EDTA。

加入后将其超声溶解。

最后加入 10μL 巯基乙醇,用去离子水补至 10mL 即可。

提取酵母DNA

  • 先讲培养箱中的酵母培养物(早对数生长期,不超过 10^7cells)在超净台中,取4支离心管,各提取1mL。

  • 吸取100μL Sorbitol buffer ,吹打充分重悬细胞,加入 5μL Lyticase,颠倒均匀,37°C 温育 30min 消化细胞壁,中间颠倒数次帮助消化。

若破壁效果不好,可以加大 Lyticase 用量。

还可以延长消化时间来提高效果, 不适台 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 等。

  • 13000 rpm 离心 1 分钟 尽可能吸弃上清 加 180μL 缓冲液YB 充分重悬细胞团。

  • 加入 20μL 的蛋白酶K溶液(20mg/mL)立刻涡旋振荡充分混匀。

  • 将混合物放置在 55°C 水浴消化直到消化完全, 期间轻柔振荡几次帮助裂解。

  • 所需消化时间一般15分钟即可, 但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。

  • 加入 200μL 结合液CB, 立刻涡旋振荡充分混匀,70°C放置10分钟。

  • 冷却后加入 100μL 异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。

  • 将上一步混合物 (包括可能有的沉淀) 加入一个吸附柱 AC 中,(吸附柱放入收集
    管中),13000rpm 离心 30-60秒, 倒掉收集管中的废液。

  • 加入500μL 抑制物去除液IR, 12000rpm 离心30秒,弃废液。

  • 加入 500μL 漂洗液WB,12000rpm 离心 30秒,弃掉废液。

  • 加入 500μL 漂洗液WB 12000rpm 离心 30秒 弃掉废液。
    将吸附柱 AC 放回空收集管中,13000rpm 离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

  • 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加 100μL 洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70°C 水浴中预热效果吏好),室温放置3-5分钟,12000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中, 室温放置2分钟,12000rpm 离心1分钟。

  • DNA可以存放在 2-8°C, 如果要长时间存放,可以放置在 -20°C。


以上